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Performance der Typ-B-DNA-Polymerase der thermophilen Euryarchie Thermococcus-Aggregate durch Mutationen in der Y-GG/A-Einheit verbessert. Die Wirkung von Mutationen im hochkonservierten Y-GG/A-Muster der Typ-B-DNA-Polymerase wurde in der DNA-Polymerase der hyperthermophilen euryarchischen Thermococcus-Aggregate untersucht. Dieses Motiv spielt eine entscheidende Rolle für das Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau der DNA-Kette. Die Mutationen von Tyrosin an der Position 387 (Tyr387?Phe, Tyr387?

Trp, Tyr387?Trp, Tyr387?Trp, Tyr387?His, Tyr387?Asn und Tyr387?Ser) haben gezeigt, dass ein aromatisches Ringsystem für die synthetische Aktivität des Enzyms unerlässlich ist.

Die Säuren ohne das Ringsystem (Ser und Asn) an dieser Stelle führten zu einer signifikanten Abnahme der Polymeraseaktivität und einer Zunahme der Exonukleaseaktivität, was zu einer verbesserten enzymatischen Treue führte. Der Tyrosinaustausch gegen Phenylalanin, Tryptophan oder Histidin hat zu Phänotypen mit ähnlicher Treue wie der Wildtyp geführt, aber mit einer verbesserten PCR-Leistung, die mit einer höheren Polymerisationsrate verbunden werden könnte.

Mit Hilfe einer modellierten Struktur aus T. aggregans DNA Polymérase wurden die biochemischen Daten interpretiert, indem vorgeschlagen wurde, dass die Konformation der flexiblen Schleife mit dem Y-GG/A-Muster ein wichtiger Faktor für das Gleichgewicht zwischen DNA-Polymerisation und Exonukleolyse ist. Im Falle der Escherichia coli Poli Typ I DNA-Polymerase und Typ B DNA-Polymerase wurde nachgewiesen, dass diese katalytischen Aktivitäten in strukturell unterschiedlichen Proteindomänen liegen (1-3).

Es handelt sich bei dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I um einen intramolekularen oder intermolekularen Prozess, der die DNA-Dissoziation und Reassoziation beinhaltet (4). Im Rahmen der Typ-B-DNA-Polymerasen, einschließlich Bakteriophage, archealer und der meisten eukaryontischen DNA-Polymerasen, wurde vorgeschlagen, die Koordination der beiden katalytischen Aktivitäten intramolekular durchzuführen, wobei das Y-GG/A (konservierte Aminosäure) Motiv zwischen der N-terminalen Exonuklease Domain 3???? und der C-terminalen Domain (2) vermittelt wird.

Dieses Motiv, das durch die Ausrichtung mehrerer Sequenzen identifiziert wurde, wurde zunächst im Bakteriophage ? (? pol) (2) replikative von ADN-Polymerase Typ B untersucht. Es handelt sich um Mutationen im Y-GG/A-Motiv, die zu Phänotypen führen, die entweder die Polymerisation oder die Exonukleolyse gegenüber dem Wildtyp-Enzym bevorzugen. Die Zusammenarbeit zwischen den Partnern kam zu dem Schluss, dass der Grund für die Kommunikation zwischen der aktiven Polymerase-Stelle und der aktiven Exonuklease-Stelle in einer Kombination aus strukturellen und funktionellen Rollen wichtig sein sollte.

Im Rahmen eines weiteren Ansatzes wurde für die DNA-Polymerase des hyperthermophilen Archaeons Solfatarikusulfolobus ( "Sso pol") eine 70-Säure-Amine (Region 1) umfassende Studie identifiziert und vorgeschlagen, die sich in einer lösungsmittelverträglichen Schleife (5) befindet. Dieses Bouquet hat sich als Bindeglied zwischen der Exonuklease und der Polymerase-Domäne erwiesen, die die Y-GG/A-Einheit enthält.

Bei den beiden verfügbaren DNA-Polymerase-Kristallstrukturen vom Typ B (6,7) befindet sich die Y-GG/A-Einheit tatsächlich in einer flexiblen Schleife und ist nicht an sekundären Struktureinheiten beteiligt. Um die Mutation von Aminosäuren in der Y-GG/A-Einheit zu analysieren, konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren dieses Teils des Sso-Pol-Enzyms die Prozessfähigkeit der Korrekturlesefunktion bestimmen (3).

Die Wirkung scheint durch einen Km-Effekt und nicht durch eine Veränderung des Kats vermittelt zu werden, die mit der beobachteten Enzym-DNA-Interaktion übereinstimmt. Die Studien zu Y-GG/A-Resten und verwandten Aminosäuren in ? und Sso pol zeigten, dass die deutlichsten Störungen der Exonuklease im Vergleich zur Polymérase durch die Mutation der Tyr- und Gly-Reste im Motiv verursacht wurden.

Das Modell für unsere Studien war die DNA-Polymerase Typ B des hyperthermophilen Archäons Thermococcus aggregans (Tag pol, GenBank Beitrittsnummer). Die Organisation wurde aus einem hydrothermalen Schlot im Tiefwasser isoliert und entwickelt sich bei einer Temperatur von 88°C optimal (9). Der natürliche Tag pol enthält drei Intellexe, die für die rekombinante Expression des Enzyms in E. coli (8) entfernt wurden.

Der Schützling hat eine Größe von 94 Kilometern pro Tag, eine optimale Temperatur von 80°C und die Fähigkeit, eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchzuführen. Die Crénarchées haben zwei (oder drei) DNA-Polymerasen der Familie B (10-12), während in euryarchischen Genomen nur eine Typ-B-DNA-Polymerase identifiziert wurde (13-16). Erneuerung der heterodimeren DNA-Polymerase-Polymerase, die für Euryarchaea einzigartig ist (17-19).

Konsequenterweise können verschiedene physiologische Rollen von DNA-Polymerasen vom Typ B in Euryarchen und Krenearchen nicht ausgeschlossen werden. Wir stellen hier Daten über Mutationen im hochkonservierten Y-GG/A-Muster von Tag pol vor, die hinsichtlich ihrer Wirkung auf Enzymaktivitäten, PCR-Leistung, Klangtreue und kinetische Parameter analysiert wurden. Die Ergebnisse werden mit Daten über Typ-B-DNA-Polymerasen von Crenarchaeon S. solfataricus und Bakteriophage verglichen ?

Die Ergebnisse zeigen, dass Mutationen im Y-GGGG/A-Muster von Tag pol zu Veränderungen in der PCR-Leistung führen, eine Tatsache, die bisher nicht erkannt wurde, da ? und Sso pol nicht in der Lage sind, in der PCR zu arbeiten. Die Ergebnisse wurden zusätzlich mit einem dreidimensionalen Tag-Pol-Modell interpretiert, das auf der kürzlich aufgelösten radiographischen Struktur der DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius basiert (7).

Die Produkte, die verwendet wurden, waren von reaktiver Qualität. Die Enzyme zur Einschränkung und Modifikation der ADN (Taq DNA-Polymerase, Pwo DNA-Polymerase, ExpandTM High Fidelity PCR System) bieten der Molekulardiagnostik von Roches, was die Indikation beeinträchtigt. Das Milieu der Säulenchromatographie stammt aus der Novagener oder Pharmazie. Les Oligonukleotide wurden bei ARK Scientific Biosystems (Darmstadt, Deutschland) oder Primm S.R.L. (Mailand, Italien) synthetisiert.

Die radioaktiven Reagenzien wurden von Amersham Life Sciences Products bezogen. Der Klonierung des Wildtyp-Tag-DNA-Polymerase-Gens wurde oben beschrieben (8). Die Mutanten, die in dieser Studie vorgestellt wurden, wurden von der PCR mit Primern vorbereitet, die die gewünschten Mutationen als Mismatches enthalten. Die Folgen der Oligonukleotidsequenzen waren wie folgt (Stellen, an denen die Mutagenese nicht ausreichend ist, werden hervorgehoben):

Die PCR-Reaktionen wurden mit dem ExpandTM High Fidelity PCR-System durchgeführt. Die 139 bp Fragmente wurden mit KpnI und SnaBI verdaut und ergeben ein 101 bp Fragment, das mit den gleichen Enzymen in den linearisierten pTYPol-Expressionsvektor eingebunden wurde. Die Schützlinge wurden in E. coli Typ B21 ("DE3") exprimiert und wie oben beschrieben gereinigt (8).

Die Tätigkeit der Polymérase wurde durch die Einarbeitung von[?-32P]dCTP in ein DNA-Modell (ssDNA DNA M13mp9) bestimmt (20). Cinquante d'équipe de messai enthielt 5 µl 10 Markierungsreaktionspuffer (100 ml Tris-HCl im Wert von 8,9, 750 ml MgCl, 15 mlCl2, 100 ml CHAPS), je 200 ml dATP, dGTP, der dGTP, der 100 ml dCTP, 1 µCi[?-32P]dCTP und 1 µg dCTP. Die Repräsentation der md. 13mp9 sDNA mit 0,3 µg de prime enthält.

Die Tests wurden mit verschiedenen Mengen an DNA-Polymerase (Endmenge des Enzyms Nr. 1. 5-15 fmol) durchgeführt und gaben sechs Reaktionen zur Berechnung eines Durchschnittswertes. Comme que enzym, Pyrococcus woesei DNA polymerease (Pwo) votre. Die Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 65°C inkubiert, mit 500 µl 10% TCA auf Eis gestoppt und 10 Minuten lang auf Eis gehalten.

Die Filtration der Proben erfolgte durch GFC-Filter (Whatman), die Filter wurden dreimal mit 5% TCA gewaschen, getrocknet und in einem ? Zähler in 2 ml Szintillationsflüssigkeit gezählt. Die spezifischen Aktivitäten der Fermente in U/pmol umfassen: Trois Enzym Picomole wurden mit 5 µg 3H markierter Kalbsthymus-DNA für 4 h bei 65°C in einem Puffer inkubiert, der 10 mM Tris-HCl ppH 8,9, 75 mMKl, 1,5 mg/Cl2 und 10 mM CHAPS enthält.

Die radioaktive Aktivität der cDNA wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Eine Einheit mit Exonuklease-Aktivität ist die Menge an Enzym, die benötigt wird, um 1 Nanometer säurelösliches Nukleotid aus der akustischen cDNA in 30 Minuten bei 65°C freizusetzen. Die Aktivitäten der spezifischen Exonuklease von Tag-Pol-Enzymen in U/pmol:: Der Test unterscheidet nicht zwischen der Aktivität 3??????? Exonuklease und der Aktivität 5??? Exonuklease.

Commezzo 5????? wurde in Thermokokken Typ B Polymerasen (21) nicht nachgewiesen, so dass die erhaltenen Werte als 3???? Exonukleaseaktivität betrachtet werden können. Die Verbesserung der mutierten PCR-Leistung wurde in einer PCR im Laufe der Zeit untersucht. Ein Fragment von 2k wurde aus der DNA von ? wie unten beschrieben amplifiziert.

Die Streitkräfte haben folgende Verwendungen: ? Eine Scheidung, 5?-GAT GAG GAG TAG TTC GTG TCC TCC TCC TCC GTA GTA CAA CAA CA-3?; ? 6 Scheine, die eintreffen, pünktlich zu den Feiertagen in den USA 5?-CTTT CAT CAT CGA GAT AGC TGT CG-3?. Die PCR mit Wildtyp- und Tagpol-Mutanten wurde in einem für diese DNA-Polymerase optimierten Puffer durchgeführt: 10 ml Tris-HCl pH 8,9, 75 ml Tris-HCl, 1,5 ml MgCl 2, 10 ml CHAPS und 200 ml µM DTP.

Die Gabarit, Primer und Nukleotide wurden in einer Mischung mit dem Namen Mischung 1 in einem Volumen von 25 µl kombiniert. Mikroliter der Mischung aus zwei verschiedenen Stoffen, die Puffer und Enzym enthalten (1 mol Tag Wild Pold-type oder Mutante; 2,5 HE Kontrollenzym) wurden hinzugefügt. Die Aktionen wurden in zweifacher Ausführung vorbereitet. Die Zyklusbedingungen waren in der Regel zwei Minuten bei 94°C, 30 Zyklen mit Denaturierung von 10 s bei 94°C, Glühen von 30 s bei 58°C und Verlängerung bei 72°C für die angegebenen Zeiten.

Die Temperaturen der Proben lagen bei 4°C. Die Reaktionen wurden mit 1 (Wildtyp, YF, YW, YH) oder 5 Uhr (für die Mutanten YN und YS) des Proteins im PCR-Puffer der oben beschriebenen Tag-Polymerase oder für Kontrollreaktionen in den PCR-Puffern des Herstellers mit 2,5 HE-Enzym durchgeführt. Die Bedingungen des Zyklus waren Denaturierung von 10 s bei 94°C, Glühen von 30 s bei 57°C und Verlängerung von 4 min bei 72°C für 18, 24 oder 30 Zyklen je nach Enzym.

Die Fragmente der DNA wurden nach dem Verdau mit ClaI aus einem präparativen Agarosegel gereinigt. Die Reaktionen wurden mit dem Rapid Ligation Kit (Roche Molecular Diagnostics) durchgeführt, Reaktionen mit 30 ng DNA. Die Plasmide wurden wie von Hanahan (24) beschrieben in E. coli DH5? umgewandelt und auf LB-Platten mit 100 mg/ml Ampicillin und 0,004% Gew./Vol. X-Gal plattiert. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden blaue und weiße Kolonien gezählt.

Le taux de erreur, d' révolution, d' équipe de l'équipée de la régustation de Keohavong et Thilly (25): worin der Anteil der weißen Kolonien (weiße Kolonien/Gesamtkolonien) und die Zahl der DNA-Duplizierungen (2d = ADN) und b die effektive Zielgröße (1080 bp) des lacI-Gens oder 349 bp gemäß Provost et al (26) ist.

Die Entlastungen, die an jeder beliebigen Stelle innerhalb des offenen Leserahmens des lacI von 1080 bp auftreten können, werden nicht berücksichtigt, da für die in der PCR verwendeten spezifischen Polymerasen mit Ausnahme der DNA-Polymerase Taq nur wenige Informationen verfügbar sind. Free und Suppman zeigten, dass katamerische Ligaturprodukte ein sehr seltenes Ereignis sowie eine schädliche Rekombination von ligierter DNA in DH5? zu sein scheinen.

Cinquante dNTPs wurden in dem vorstehend beschriebenen Polymerasepuffer mit variablen Mengen an dNTPs durchgeführt und ein Modell des ADN L13mp18 initiiert. Die ADN SSDNS M1mp18 DNA wurde mit einer äquimolaren Menge eines Oligonukleotids 24mer getempert, indem man 5 Minuten lang auf 80°C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlt. Im Falle von DNA-Parametern wurde die dNTP-Konzentration von dATP, dTTP und dGTP auf 200 µM, dCTP auf 20 µM und[?-32P]dCTP auf 3,5 µM (3 µCi/pmol) festgelegt.

Die Maßnahmen wurden durch die Zugabe von 1 Uhr Enzym ausgelöst, um die auf 70°C vorgewärmten Mischungen zu messen, die in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel durchgeführt wurden, um eine Verdampfung zu verhindern. Die Microliter -Proben wurden in Abhängigkeit von der Zeit entnommen, die Reaktion stoppte auf Eis und wurde auf dem zweiten identifiziert. Die Werte in Tabelle 1 entsprechen der Aktivität von 0,2 µm Enzym (10 µl von 50 µl Reaktion).

Die[ ?-32P]dCTP wurde durch drei Waschschritte in 0,3 Mio. Ammoniumformiat (pH 8,0) entfernt, gefolgt von einem Waschschritt in 95%igem Äthanol und einem Waschschritt mit Diéthyléther. Die Filter wurden in Ampullen mit 2,5ml Flüssigflüssigkeit gezählt. Die Analysen wurden mit einer bekannten Menge[?-32P]dCTP auf DE81-Filtern kalibriert, ohne die Waschschritte.

Die Werte von Km und max wurden durch Regressionsanalyse mit dem Programm Grazit (29) berechnet. 05± 0. 03n.d. Für die Modellierung der Tag DNA-Polymerasenstruktur, wurde die Kristallstruktur der T. gorgonarius (Tgo) DNA-Polymerase verwendet (PDB 1TGO) (7). "Typ": "Enter-Nukleotid", "Attrs": "Text": "A79152", "term_id": "6092198", "term_text": "A79152"}}A79152) wurden mit dem Programm CLUSTALX (30) abgestimmt.

Die Abstimmung der Sequenzen wurde als Grundlage für die homologische Modellierung mit WHAT IF (31) verwendet. Im Rahmen der Ausrichtung wurden zwei kurze Insertionen in der Tag-Pol-Sequenz, eine einzige einfache Einfügung und eine Einfügung von zwei Aminosäuren, nachgewiesen. Die Einbringung von beiden Aminosäuren liegt weit entfernt von der Position des Tyrosins.

Das Einführen einer einzelnen Aminosäure (d.h. Leu an Position 383) befindet sich in unmittelbarer Nähe des untersuchten Sequenzmusters (siehe Abb. 1). Modifizieren der Schleife, die das Y-GG/A-Muster enthält, wurde interne Logik (K. Paliakasis und C. Vorgias, unveröffentlichte Ergebnisse) in Kombination mit WHAT IF verwendet.

Die Angleichung einer 24-25 Aminosäure-Region, die die Y-GG/A-Einheit in den archäischen DNA-Polymerasen vom Typ B umgibt, erfolgt mehrfach sequentiell. Neben dem Y-GG/A konservierten Muster selbst sind auch die Reste V, P und G (fett gedruckt) in den archäologischen Enzymen erhalten. Die Konservativen, die in den Typ-B-DNA-Polymerasen der Euryarchie gelagert sind, sind grün markiert, die charakteristischen Reste der B1-DNA-Polymerasesequenzen der creenarchalen DNA sind blau markiert.

Eine weitere interessante Eigenschaft ist eine Gruppe von positiv geladenen (roten) Aminosäuren vor dem Y-GG/A-Motiv in beiden archäologischen Subdomänen, Arg (R) bei euryarchischen Sequenzen und Lys (K) bei kernarchalen Sequenzen. Les mutants de la mutantes de tag pol, que vous vous votre.

Die Astronomen markieren die analogen Mutanten, die in ? und Sso pol (2,3) untersucht wurden. Die Studie hatte zum Ziel, die Rolle des Y-GG/A-Motivs in der DNA-Polymerase hyperthermophiler T-Aggregate von Euryarchäon T. aggregans zu untersuchen. Dieses Motiv würde die enzymatische DNA-Synthese und den DNA-Abbau in den Typ-B-DNA-Polymerasen des Bakteriophagen ? (2) und des Sso creaturearchaeon (3) koordinieren.

Die Unterscheidung im sequentiellen Kontext des Y-GG/A-Musters der kreaturspezifischen DNA-Polymerase im Vergleich zur euryarchischen DNA-B-Polymerase (Abb. 1) war daher interessant, die Rolle dieses Musters auch in einer euryarchischen DNA-B-Polymerase zu testen. Dans Tag pol, de Y-GG/A muster is op positionen 387-390.

Nous avons de Tyr387 à Ser y Phe (die Mutanten werden YS bzw. YF genannt) et de erste Gly (Gly398) à Ala (GA) (Abbildung 1). Die analogen Mutanten wurden in ? pol und Sso pol (2,3) untersucht. Außerdem haben wir drei weitere Mutanten in der Position von Tyr387 durch Insertion von Ihm, Trp und Asn (entsprechende Mutanten namens YH, YW und YN) produziert.

In den Enzymen Wildtyp und Mutante pol Tag wurden die Exprimierten und Gereinigten wie oben beschrieben (8). Die Mutanten wurden auf nahezu homogene Weise gereinigt und zeigten Löslichkeit und chromatographisches Verhalten ähnlich dem des Wildtyp-Enzyms, was darauf hindeutet, dass die Mutationen keine größeren strukturellen Veränderungen bewirkten (Daten nicht dargestellt). Die Aktivität der Polymérase von Wildtyp- und mutierten Enzymen wurde an der initiierten M13mp9-DNA gemessen.

Wenn Sie Ihre Polymeraseaktivität bestimmen, können Sie Mutanten definieren als: i) Mutanten mit erhöhter Polymerase(YF)-Aktivität; ii) Mutanten mit im Wesentlichen unveränderter Polymerase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp (YW und YH); und iii) Mutanten mit deutlich reduzierter Polymerase-Aktivität (YN, YS und GA) (Tabelle 1). Quantitativ wurden die Mutanten in zwei Gruppen eingeteilt, gemessen an der DNA des mit 3H markierten Wadenthymus:

i) Mutanten mit exonukleolytischer Aktivität vom Wildtyp (YF, YW und YH) und ii) Mutanten mit erhöhter Exonukleaseaktivität (YN, YS und GA, Tabelle 1). Um die Ergebnisse mit denen früherer Studien (2,3) und zwischen den in dieser Studie erhaltenen isolierten Mutanten zu vergleichen, haben wir den Quotienten aus Polymerase (pol) und Exonuklease (exo) berechnet.

Die erste Gruppe ist gekennzeichnet durch eine Polymerase-Aktionsquotient/Exo-Exonuklease der gleichen Größenordnung wie Wildtyp-Tagpol (YF, YW, YH; Pol/Exo-Wildtyp-Verhältnis = 1), die zweite Gruppe durch einen Pol/Exoquotienten deutlich

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